Una hidrolasa es una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de un enlace químico. Por ejemplo, una enzima que catalice la reacción siguiente será una hidrolasa:

A–B + H₂O → A–OH + B–H

La nomenclatura sistemática denomina a estas enzimas como sustrato hidrolasa; no obstante, aún se emplea la nomenclatura tradicional de sustratoasa. Por ejemplo, el ácido nucleico hidrolasa se conoce como nucleasa. Las enzimas digestivas pertenecen a esta categoría.

Pertenecen a la categoría EC 3 en la numeración EC. Poseen como subclases:

• EC 3.1: Actúan sobre enlaces éster. (Esterasas, nucleasas, fosfodiesterasas, lipasas, fosfatasas)
• EC 3.2: Glucosidasas.
• EC 3.3: Actúan sobre enlaces éter.
• EC 3.4: Actúan sobre enlaces peptídicos. (Peptidasas)
• EC 3.5: Actúan sobre enlaces carbono-nitrógeno no peptídicos.(Arginasas)
• EC 3.6: Actúan sobre los anhídridos de los ácidos. (Helicasas, GTPasa)
• EC 3.7: Actúan sobre los enlaces carbono-carbono.
• EC 3.8: Actúan sobre los enlaces haluro.
• EC 3.9: hidrolizan enlaces P - N

EC 3.9.1.1 fosfoamidasa

EC 3.9.1.2 proteína arginina fosfatasa

EC 3.9.1.3 fosfohistidina fosfatasa

• EC 3.10: hidrolizan enlaces S - N

EC 3.10.1.1 N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa

EC 3.10.1.2 ciclamato sulfohidrolasa

• EC 3.11 hidrolizan enlaces C - P

EC 3.11.1.1 fosfonoacetaldehído hidrolasa

EC 3.11.1.2 fosfonoacetato hidrolasa

EC 3.11.1.3 fosfonopiruvato hidrolasa

• EC 3.12 hidrolizan enlaces S - S

EC 3.12.1.1 tritionato hidrolasa

• EC 3.13 hidrolizan enlaces C - S

EC 3.13.1.1 UDP-sulfoquinovosa sintasa

EC 3.13.1.2 eliminada, transferida a EC 4.4.1.21

EC 3.13.1.3 2'-hidroxibifenil-2-sulfinato desulfinasa

EC 3.13.1.4 3-sulfinopropanoil-CoA desulfinasa

EC 3.13.1.5 carbon disulfide hidrolasa

EC 3.13.1.6 [proteína acarreadora de azufres]-S-L-cisteína hidrolasa

EC 3.13.1.7 carbonil sulfuro hidrolasa

EC 3.13.1.8 S-adenosil-L-metionina hidrolasa (forma adenosina)

• Fosforilasa

• EC 3 Introductionfrom the Department of Chemistry at Queen Mary University of London, only covers 3.1-3.4